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金黄色葡萄球菌的实验室检测方法
点击次数:2732 发布日期:2019-7-2  来源:北京百欧博伟生物技术有限公司
金黄色葡萄球菌检测方法
 
 (Staphylococcus aureus ) 是人类的一种重要病原菌,隶属于葡萄球菌属(Staphylococcus),有“嗜肉菌"的别称,是革兰氏阳性菌的代表,可引起许多严重感染。而对于金黄色葡萄球菌在速冻食品中的存在量,卫生部于2011年11月24日公布食品安全国家标准《速冻面米制品》,允许金葡菌限量存在。今天我们主要来了解一下它的检测方法。

一、材料与方法
1、材料
①培养基:7.5%NaCl肉汤培养基,血琼脂平板培养基(按常规方法制作)
②试剂:7.5%NaCl肉汤培养基,革兰氏染色,血琼脂平板,Baird-Parker琼脂平板,生理盐水,兔血浆(1:4)
③器材:温箱,显微镜,天平,均质器,载玻片,L型涂片棒,三角瓶,刻度吸管,平皿,试管及试管架,研磨,1ml注射器,
④实验动物:健康的小白鼠
2、方法
待检样品25g+225ml 灭菌生理盐水
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  直接计数法 增菌培养方法
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  Baird-Parker琼脂平板 7.5%NaCl肉汤培养基
  ↓ ↓
  血平板 血平板
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  ↓
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  ↓ ↓ ↓ ↓
  涂片染色镜 溶血观察 动物接种试验 血浆凝固试验
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  ↓
  报告

二、实验步骤
1、样品的采集
称取25g火腿肠,切碎搅匀(用灭菌研钵研磨),置于250ml 锥形瓶中,加入225ml 灭菌生理盐水,制成1:10样品混悬液,混匀后作用20分钟,随机取10ml 离心。
2、增菌及分离培养
①增菌培养方法:吸取5ml上清液,接种于7.5%NaCl肉汤培养基内,置于(37±1℃)恒温箱中培养24h,划线接种入血平板,(37±1℃)恒温箱中培养24h。
②直接计数方法:吸取上述悬液,进行10倍递增稀释,根据样品污染情况,选择不同浓度的稀释液各1ml,分别加入3个Baird-Parker琼脂平板,每个平板的接种量分别为0.3ml、0.3ml、0.4ml。用灭菌L型涂布棒涂布整个平板,置于(37±1℃)恒温箱中培养24h。之后分别对3个平板上生长的周围有浑浊带的黑色菌落进行计数。转接入血平板,(37±1℃)恒温箱中培养24h。
3、涂片、染色与镜检
将纯培养的未知菌涂片,革兰氏染色,显微镜观察。
4、生化实验
①触酶试验
在载玻片上滴1滴3%的过氧化氢,调取纯化的细菌放在过氧化氢中观察变化。30s内产生大量气泡者为阳性,不产生气泡者为阴性。
②血浆凝固酶试验
吸取1:4新鲜兔血浆0.5ml,放入小试管中,再加入培养24h的2①中的肉汤培养液0.5ml,摇荡均匀,放入(37±1℃)恒温箱中培养,每0.5h观察一次,观察6h,检查是否出现凝固。将试管倾斜或倒置时,呈现凝块状,可判定为阳性,同时以已知阳性葡糖球菌和阴性肉汤作为对照。
5、动物感染实验
用无菌生理盐水将2①中血琼脂板上纯化的菌落洗下后,以0.5ml/只腹腔注射入小白鼠体内,同时用灭菌生理盐水注射入另外的小白鼠体内,以做对照,分别在相同条件饲养,观察其症状。对感染试验出现症状或死亡的小白鼠进行剖检,并采集病料,进行分离。

三、结果与分析
1、培养特性及形态特征
①培养特性
在37℃条件下,需氧与厌氧培养的血液营养琼脂平板均长出光滑、湿润、隆起,约1mm大小的金黄色菌落,并且有β溶血现象。
②镜检结果
显微镜下观察该菌为革兰氏阳性球菌,排列成葡萄串状,也有个别2个或3个球菌相连。根据菌落形态、镜检结果怀疑该菌为葡萄球菌。
2、菌落计数报告
将直接计数法试验中的3个平板中疑似黑色葡萄球菌的金黄色菌落数相加,乘以血浆凝固酶试验阳性数,除以5,在乘以稀释倍数,即为每克样品中金黄色葡萄球菌数量。
3、动物感染试验
只注生理盐水的小白鼠没有任何变化:接种分离菌的小白鼠在9h内死亡。将死亡的小白鼠剖检采集病料,进行细菌分离和生化试验,得到与原分离菌。
“金球菌”列为“极重要质量项目”
因思念、三全、湾仔码头事件而引发标准争议,在2011年12月21日实施的速冻食品新国标中,金黄色葡萄球菌从原来“不得检出”变为“限量检出”,但这一检测标准的改变并不代表可以忽略金黄色葡萄球菌的危害性。
在市质监局征集意见而公示的抽检项目中查询到,对包括速冻水饺、汤圆、包子、花卷、馒头、南瓜饼、八宝饭等在内的速冻米面食品,仍然计划把金黄色葡萄球菌列入A类检验项目,并标注为“极重要质量项目”,同时速冻米面食品的沙门氏菌也是A类检验。
速冻食品“金球菌”可限量检出
中国现行《速冻预包装面米食品卫生标准》(GB19295-2003)规定金黄色葡萄球菌等致病菌不得检出。
而卫生部于2012年12月21日实施的《速冻面米制品食品安全国家标准》,将金黄色葡萄球菌检测由定性转向定量,规定每批产品抽检5个样品中,至多只能有1个样品每克生制品中检出的金黄色葡萄球菌含量在1000至10000个之间。 

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